Modifications post-traductionnelles des protéines
Ubiquitination : mécanismes
Transfert final et spécificité des ligases E3

L’ubiquitine doit, pour se fixer sur la protéine cible, processus appelé ubiquitination ou ubiquitinylation, recourir à une succession coordonnée d’enzymes spécifiques agissant de manière séquentielle.

• L'enzyme d’activation (E1) active l’ubiquitine par une réaction ATP-dépendante pour former un intermédiare thioester (E1~Ub)
• L'enzyme de conjugaison (E2) reçoit ensuite l’ubiquitine activée depuis E1 pour générer le complexe E2~Ub.
• L'enzyme ligase (E3) reçoit le complexe E2~Ub, reconnaît le substrat, oriente les partenaires et catalyse la formation de la liaison isopeptidique reliant l’ubiquitine à la protéine cible.

Ces trois étapes s’enchaînent de manière ordonnée pour aboutir à la formation d’un pont isopeptidique entre la glycine C-terminale (G76) de l’ubiquitine et une lysine du substrat, assurant ainsi la fixation covalente du signal ubiquitine.

Transfert de l'ubiquitine sur E3

L'enzyme ligase (E3) catalyse la formation d’un pont isopeptidique entre le groupe carboxyle de la glycine terminale (G76) de l’ubiquitine et le groupe ε-amine d’une lysine du substrat, i.e. catalyse facilitée par l'énergie stockée dans la liaison thioester E2~Ub selon deux mécanismes :

• directement, de l’enzyme E2 vers le substrat, dans le cas des E3 de type RING,
• indirectement, par l’intermédiaire d’un thioester transitoire formé sur la cystéine catalytique de l’E3, caractéristique des familles HECT et RBR.

1. L’activité de l’enzyme E3 ne se limite pas à transférer mécaniquement l’ubiquitine : elle consiste avant tout à organiser la configuration catalytiquement réactive entre les partenaires du complexe.

a. E3 stabilise la conformation activée d’E2~Ub.

• 

  L’E3 induit une déformation conformationnelle du complexe E2~Ub, en particulier au niveau de la liaison thioester entre E2 et l’ubiquitine.
• Cette contrainte structurelle place l’ubiquitine dans un état " tendu " ou activé, favorable à la rupture contrôlée de la liaison thioester et au transfert du groupement carbonyle terminal vers le substrat.

b. E3 oriente les groupements réactifs.

• En rapprochant spatialement l’ubiquitine donneuse et la lysine (ou l’amine N-terminale) du substrat, l’E3 aligne les orbitales électroniques du groupement carbonyle de la Gly76 de l’ubiquitine et de l’amine ε de la lysine cible.
• Cette orientation optimale facilite la formation de la liaison isopeptidique, tout en limitant les réactions parasites.

c. E3 abaisse l’énergie d’activation de la réaction de transestérification ou d’aminolyse.

• L’E3 stabilise l’état de transition de la réaction, réduisant ainsi l’énergie nécessaire à la transestérification dans le cas des E3 de type HECT et RBR, ou à l’aminolyse directe, i.e. attaque nucléophile d’un groupement carbonyle par une amine, pour les E3 de type RING.
• Ce rôle catalytique subtil explique que certaines mutations de résidus de surface des E3, sans affecter la chimie du site actif, puissent abolir l’activité enzymatique en perturbant cet équilibre conformationnel de pré-organisation.

2. La nature de la liaison formée dépend du site accepteur :

• lysine du substrat, liaison isopeptidique classique, observée, par exemple, lors de la polyubiquitination de p53 par la ligase MDM2, signalant sa dégradation protéasomale,
• extrémité N-terminale pour la formation de chaînes linéaires M1 catalysée par le complexe LUBAC impliqué dans la signalisation NF-κB,
• plus rarement, sérine, thréonine ou cystéine dans des ubiquitinations non canoniques, comme celle des protéines NEMO ou MAVS, observée au cours des réponses antivirales ou inflammatoires.

Ces variations dans le site accepteur et la nature du lien formé reflètent la diversité fonctionnelle des ligases E3, dont le mécanisme catalytique diffère selon la famille structurale à laquelle elles appartiennent.

Variantes du mécanisme catalytique selon les famillesd

Le mécanisme catalytique des ligases E3 présente deux variantes principales, selon que le transfert de l’ubiquitine s’effectue directement ou via un intermédiaire covalent.

Cette distinction reflète la nature chimique du rôle joué par l’E3 dans la réaction et la diversité structurale de ses domaines catalytiques.

Transfert direct par les familles RING et U-box

Les ligases E3 des familles RING (Really Interesting New Gene) et U-box catalysent un transfert direct de l’ubiquitine depuis l’enzyme de conjugaison E2~Ub vers la protéine cible, sans formation d’intermédiaire covalent sur l’E3.

1. Le domaine RING, stabilisé par deux ions Zn⁺⁺, et le domaine U-box, de repli similaire, mais dépourvu de zinc, jouent un rôle analogue en servent de plateformes de positionnement permettant la liaison simultanée du complexe E2~Ub et du substrat :

• une face interagit avec l’enzyme E2 chargée d’ubiquitine (E2~Ub),
• l’autre reconnaît la protéine substrat directement ou via une sous-unité adaptatrice.

a. Le rôle catalytique principal du domaine RING consiste à activer le complexe E2~Ub en favorisant sa transition vers une conformation " fermée " ou tendue.

• Dans cet état, l’ubiquitine est partiellement détachée de l’E2 et orientée de façon optimale pour le transfert de son groupement carbonyle terminal vers la lysine du substrat.
• Cette activation résulte d’interactions précises entre la surface hydrophobe de l’ubiquitine et des résidus conservés du domaine RING, souvent Phe, Leu ou Ile, qui stabilisent l’état de transition du lien thioester E2~Ub.

b. La réaction procède par une aminolyse directe, i.e. le groupement amine ε de la lysine du substrat attaque le carbone carbonyle du lien thioester E2~Ub, entraînant la formation de la liaison isopeptidique entre la Gly76 de l’ubiquitine et la lysine cible.

2. De nombreuses E3 de type RING fonctionnent dans des complexes modulaires, où la reconnaissance du substrat est assurée par des sous-unités distinctes :

• les CRL (Cullin-RING Ligases), dont la sous-unité Rbx1/Rbx2 porte le domaine RING et recrute l’E2~Ub, tandis que les adaptateurs, i.e. F-box, BTB, DCAF assurent la spécificité du substrat.
• le complexe APC/C, dont le module catalytique APC11-APC2 est activé successivement par Cdc20 ou Cdh1 selon la phase du cycle cellulaire.

Ce mode d’organisation confère aux E3 RING une grande rapidité catalytique et une spécificité élevée, adaptées à la régulation fine de processus tels que :

• la dégradation protéasomale, i.e. p53/MDM2, p27^Kip1/SCF^Skp2,
• la régulation du cycle cellulaire, i.e. cyclines A, E, B,
• la signalisation membranaire, Cbl et les récepteurs tyrosine-kinase (RTK).

Transfert indirect par
les familles HECT et RBR

La famille HECT et la famille RBR effectuent ce processus en deux étapes successives, impliquant la formation d’un intermédiaire thioester sur la cystéine catalytique de l’E3.

• L'ubiquitine est transférée du complexe E2~Ub vers une cystéine catalytique de l’E3, formant un intermédiaire covalent E3~Ub.
• L’ubiquitine est ensuite transférée de cette cystéine vers la lysine ou parfois vers un autre acide aminé du substrat cible, produisant la liaison isopeptidique définitive.

Ce mécanisme confère à ces ligases une plus grande plasticité catalytique, leur permettant de contrôler finement la topologie et la longueur des chaînes d’ubiquitine formées.

Ligases de type HECT

1. Les ligases HECT sont des enzymes monomériques comportant un domaine catalytique HECT.

a. Ce domaine est divisé en deux lobes :

• 

  le lobe N-terminal (N-lobe), qui se lie à l’enzyme E2~Ub,
• le lobe C-terminal (C-lobe), qui contient la cystéine du site catalytique qui forme le thioester avec l'ubiquitine.

b. La flexibilité d’une charnière souple reliant ces deux lobes permet une rotation de bascule qui transfère l’ubiquitine du site E2 au substrat.

c. Cette propriété rend le système HECT particulièrement adapté à la formation de chaînes polyubiquitine de topologies variées, i.e. K48, K63, K11…

2. Les ligases HECT participent à de nombreux processus cellulaires :

• UBE3A (E6AP), impliquée dans la dégradation de p53 et dans le syndrome d’Angelman,
• NEDD4 et ITCH, régulatrices de la signalisation des récepteurs membranaires et du trafic endosomal,
• HERC, famille de grandes ligases HECT modulant la dynamique cytosquelettique et le transport vésiculaire.

Ligases de type RBR

1. Les ligases RBR présentent un mécanisme hybride combinant les caractéristiques des RING et des HECT.

a. Elles contiennent trois modules successifs ( structure des RBR) :

• un RING1, qui recrute l’enzyme E2~Ub,
• un IBR (In-Between-RING) de liaison,
• un RING2, dont la cystéine catalytique forme un intermédiaire thioester avec l’ubiquitine.

b. Ainsi, les RBR associent le recrutement de type RING à une catalyse de type HECT.

2. Les E3 RBR connues incluent :

• la parkine, dont l’activation dépendante de PINK1 contrôle l’élimination des mitochondries endommagées ( mitophagie),
• HHARI, présentant une autoinhibition levée par des signaux post-traductionnels,
• HOIP, sous-unité catalytique du complexe LUBAC, responsable de la formation de chaînes linéaires M1 et de la régulation de la signalisation NF-κB.

Importance fonctionnelle

1. Les ligases de type HECT et RBR sont plus lentes que les RING, mais leur capacité à former un intermédiaire covalent leur confère une souplesse catalytique supérieure.

Elles peuvent :

• reconfigurer la topologie des chaînes ubiquitine,
• moduler la sélectivité des substrats,
• intégrer des mécanismes de régulation allostérique ou post-traductionnelle, i.e. phosphorylation, ubiquitination secondaire, interaction cofacteur.

2. Ce mode de transfert indirect permet un contrôle fin et modulable de l’ubiquitination, essentiel dans des processus tels que :

• la signalisation cellulaire,
• la réponse au stress,
• la régulation du cycle cellulaire,
• la mitophagie.

Remarque : si l'ubiquitine est, en général, transférée à l'extrémité N-terminale des protéines, elle peut aussi se lier à d'autres acides aminés comme la thréonine, la sérine ou la cystéine (Ubiquitylation of an ERAD substrate occurs on multiple types of amino acids 2010).

Mono et polyubiquitination