Trafic vésiculaire : endocytose clathrine-dépendante (CME)
7b. Déshabillage de la vésicule : auxilline et mécanisme

7. Quand la vésicule est entièrement internalisée, elle perd rapidement son revêtement de clathrine pour pouvoir fusionner plus facilement avec les endosomes précoces.

Ce déshabillage nécessite :

• Hsc70 (70 kDa), protéine appartenant à la famille des protéines de choc thermique et des protéines chaperons ;
• plusieurs protéines qui sont présentées comme des co-chaperons de Hsc70, dont l'auxilline/GAK (A sequential mechanism for clathrin cage disassembly by 70-kDa heat-shock cognate protein (Hsc70) and auxilin 2011).

Co-chaperons de Hsc70 : auxilline

Vue d'ensemble

1. L'auxilline/GAK (cyclin G-Associated kinase) fait partie de la famille des NAK (numb-associated kinase).

Chez l'homme, cette famille, dont les membres présentent une grande diversité de séquences et de structures par rapport aux autres kinases ainsi qu'au sein de leur famille comprend aussi (Family-wide Structural Analysis of Human Numb-Associated Protein Kinases 2016) :

• STK16 (Serine/Threonine Kinase 16)/MPSK1 (Myristoylated and Palmitoylated Serine/Threonine Kinase 1), protéine associée à la membrane qui est principalement localisée au Golgi et participe à la voie de signalisation TGF-β, à la sécrétion et au tri des protéines du réseau trans-Golgi (TGN), au cycle cellulaire et à la régulation de l'assemblage du Golgi (Serine/Threonine Protein Kinase STK16 2019),
• AAK1 (Adaptor-Associated Kinase 1), impliquée dans la phosphorylation de la sous-unité μ2 de AP-2,
• BIKE [BMP2 (bone morphogenetic protein 2)-inductible kinase].

2. L'auxilline fait partie des co-chaperons de Hsc70 (A burst of auxilin recruitment determines the onset of clathrin-coated vesicle uncoating 2006 et Recruitment dynamics of GAK and auxilin to clathrin-coated pits during endocytosis 2006 et Structure of clathrin coat with bound Hsc70 and auxilin: mechanism of Hsc70‐facilitated disassembly 2009).

3. GAK est un partenaire de la cycline G et de CDK5 et parmi ses fonctions connues, certaines sont partagées avec AAK1. Elle est essentielle :

• au trafic de clathrine en assurant la liaison à la membrane plasmique et auréseau trans-Golgi (TGN),
• au maintien de la maturation du centrosome et de la progression de la mitose.

4. Les GAK agissent comme l'AAK1, sérine/thréonine kinase qui phosphoryle la sous-unité μ des adaptateurs classiques pour multiplier par 100 leur affinité pour le cargo et la membrane.

Elles sont impliquées dans le trafic des récepteurs comme le récepteur du facteur de croissance épidermique (Multiple Roles for Cyclin G-Associated Kinase in Clathrin-Mediated Sorting Events 2005).

5. Lors du recrutement de la dynamine pour détacher la vésicule de la membrane, on constate un pic de recrutement de l'auxilline et une augmentation du PI(3,4)P2 (A burst of auxilin recruitment determines the onset of clathrin-coated vesicle uncoating 2006).

Structure de l'auxilline

Deux isoformes d'auxiline étroitement apparentées sont trouvées chez l'homme.

1. GAK (cyclin G–Associated Kinase, encore appelée auxilline 2), exprimée dans toutes les cellules, possède :

• un domaine sérine/thréonine kinase,
• un domaine PTEN-like pour la liaison aux lipides,
• un domaine de liaison à la dynamine et à la clathrine,
• un domaine J C-terminal.

2. L'auxilline 1, exprimée principalement dans les neurones ne possède pas de domaine kinase N-terminal.

L'auxilline comprend plusieurs domaines (Structure of cyclin G-associated kinase (GAK) trapped in different conformations using nanobodies 2014).

Domaines de liaisons aux protéines

Domaine J

1. Le domaine J de l'auxilline recrute Hsc70 et active son activité ATPasique pour qu'il puisse ouvrir son " couvercle " (NMR Structure of the J-domain and the Gly/Phe-rich Region of theEscherichia coliDnaJ Chaperone 1996 et The J-protein family: modulating protein assembly, disassembly and translocation 2004).

• Le domaine J est retrouvé à l'extremité N-terminale des JDP (J-Domain Protein) de classe A et B, et n'mporte où dans la classe C (The Hsp70 chaperone machinery: J-proteins as drivers of functional specificity 2010)
• Les JDP de classe A et de classe B sont considérés comme des co-chaperons généraux qui interagissent avec des protéines dépliées, mal repliées ou agrégées et les transfèrent à Hsp70.

2. Le domaine J est une structure en épingle à cheveu de 70 à 75 acides aminés.

• Ce domaine contient un motif HPD (H35, P36, D37) situé dans une boucle entre les deux hélices principales (II et III), essentiel pour stimuler l'activité ATPase de Hsc70.
• Cette hydrolyse permet le changement conformationnel des Hsc70 en déplaçant le SBD du NBD et permettre ainsi sa liaison au substrat, ici le motif QLMLT des domaines C-terminaux des chaînes lourdes ( mécanisme général de Hsc70).

Autres domaines de liaison

1. L'auxilline possède un domaine de liaison à la clathrine et à l'AP2 (résidus 547-910).

• Ce domaine contient plusieurs sites de liaison caractérisés par une gamme de motifs (DLL, MTP, WDW et NWQ).
• Les motifs principaux, entre les résidus 547 à 714, sont censés se lier principalement à la cuisse, partie proximale (CHCR6 et 7).
• Les motifs entre les résidus 716 à 910 sont censés se lier principalement à la jambe (Multiple Interactions of Auxilin 1 with Clathrin and the AP-2 Adaptor Complex 2001 et Structure of clathrin coat with bound Hsc70 and auxilin: mechanism of Hsc70-facilitated disassembly 2009).

2. Le domaine de liaison à la dynamine précède le domaine précédent.

Domaines de liaisons aux lipides

1. Le domaine de liaison aux lipides est composé d'un domaine PTEN-like (Phosphatase and TENsin homolog) qui contient :

• le domaine phosphatase-like (PD : résidus 54–216),
• le domaine C2 de type 2 (résidus 226–363).

Normalement, le domaine de la phosphatase PTEN déphosphoryle les PI(3,4,5)P3 ou PIP3 de la membrane (au niveau du 3-phosphate du cycle inositol : ce sont des 3-phosphatases) pour produire du PI(4,5)P2 ou PIP2.

Le domaine PTEN-like a seulement 27% d'homologie avec le PTEN classique (Interactions of the Auxilin-1 PTEN-like Domain with Model Membranes Result in Nanoclustering of Phosphatidyl Inositol Phosphates 2013).

2. Le domaine PD n'a pas d'activité catalytique.

Toutefois, il se lie à la membrane de manière non spécifique par ses résidus chargés positivement 53-60 et 88-99 .

3. Le domaine C2 de type 2 de l'auxilline a la particularité de ne pas comporter, comme de nombreux autres, les résidus impliqués la liaison membranaire Ca⁺⁺ dépendante ( structure de la phosphatase PTEN).

Le domaine C2 est essentiel pour le recrutement et l'association de l'auxilline avec les vésicules de clathrine(Structure of the PTEN-like Region of Auxilin, a Detector of Clathrin-Coated Vesicle Budding 2010).

• Son absence ne permet pas la liaison.
• il semble être le détecteur qui signale le détachement de la vésicule de la membrane plasmique.

Le domaine C2 comporte une boucle 3 plus longue que celle du PTEN classique.

• Cette boucle en forme d'épingle β torsadée est impliquée dans l'interaction avec la bicouche lipidique par ses résidus chargés positivement 240–245 et 301–316.
• Les lipides chargés négativement, en particulier PI(4,5)P2 ou PIP2 se lient à eux.

• L'extrémité C-terminale du domaine PTEN est positionné de telle sorte que la chaîne polypeptidique qui suit pourrait faire saillie de la membrane vers le manteau de clathrine.
• Les 150 résidus d'acides aminés entre l'extrémité du domaine PTEN-like et la région de liaison à la clathrine pourraient facilement enjamber l'espace entre l'emplacement du domaine J de l'auxilline dans le manteau de clathrine et la membrane de la vésicule.

Mécanisme du déshabillage

L'auxilline se lie à l'intérieur de la jambe de la chaîne lourde de la clathrine, le domaine J tourné vers le sommet.

• Le domaine J recrute l'Hsc70.
• L'Hsc70 se lie par la fente du domaine SBD, " couvercle ouvert " par l'hydrolyse de l'ATP, au motif QLMLT des domaines C-terminaux des chaînes lourdes de clathrine pour déstabiliser le manteau (Structure of clathrin coat with bound Hsc70 and auxilin: mechanism of Hsc70-facilitated disassembly 2009).

1. La liaison du complexe auxilline/Hsc70 au motif QLMLT du triskélion " déplace " les chevilles de deux autres triskélions (Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating 2011).

• Ces chevilles sont connectées aux jambes qui sont essentielles à l'assemblage du manteau de clathrine, ce qui déstabilisera l'ensemble pour éjecter le triskélion.
• Le mécanisme exact est encore en cours d'étude.

2. Le triskélion est encore lié au Hsc70 pour qu'une agrégation aberrante de clathrine ne forme pas de cage dans le cytosol (The role of molecular chaperones in clathrin mediated vesicular trafficking 2015).

• Cette séquestration doit être régulée de telle manière que la clathrine soit libérée et disponible pour un nouveau cycle d'endocytose.
• L'auxilline est recyclée (Multiple Roles of Auxilin and Hsc70 in Clathrin-Mediated Endocytosis 2007)

3. La dissociation de la clathrine de Hsc70 est contrôlée probablement par les NEF (Nucleotide Exchange Factors).

• Le NEF provoque la libération de l'ADP de Hsc70 qui formait un complexe très stable avec la clathrine.
• Ce NEF est probablement Hsp110 de la même famille que Hsp70 (Unique Peptide Substrate Binding Properties of 110-kDa Heat-shock Protein (Hsp110) Determine Its Distinct Chaperone Activity 2011)

4. Un nouvel ATP peut alors se lier au complexe Hsc70/clathrine pour le dissocier.

8. Incorporation dans les endosomes précoces

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