La réplication de l’ADN est le processus par lequel la cellule duplique fidèlement son génome avant la division cellulaire, depuis l’activation des origines de réplication et l’ouverture de la double hélice jusqu’à la synthèse des nouveaux brins d’ADN complémentaires.
Principe de la réplication
La réplication de l’ADN correspond au processus par lequel une cellule copie l’ensemble de son génome avant la division cellulaire.
1. Ce mécanisme permet la transmission fidèle de l’information génétique aux cellules filles.
Réplication semi-conservative
(Figure : vetopsy.fr d'après Jiménez)
La réplication de l’ADN est semi-conservative, i.e. chaque molécule d’ADN fille contient un brin parental conservé et un brin nouvellement synthétisé, conformément au principe de complémentarité des bases ( synthèse de l'ADN).
La réplication est également bidirectionnelle, i.e. à partir d’un point d’initiation, la duplication du génome progresse dans deux directions opposées le long de la molécule d’ADN ( direction de la synthèse de l'ADN).
2. Ce processus nécessite la coordination d’un grand nombre de protéines formant un complexe de réplication qui assure :
Synthèse dans le brin directeur et retardé de la fourche de réplication eucaryote
(Figure : vetopsy.fr d'après Nasheuer et coll)
Licensing et activation des origines de réplication
La réplication de l’ADN débute dans de multiples régions spécifiques du génome appelées origines de réplication.
Une origine de réplication est un site défini du génome sur lequel les protéines de réplication (licensing factors) s’assemblent afin d’initier l’ouverture de l’ADN et le démarrage de la réplication.
Chez les eucaryotes, chaque chromosome possède de nombreuses origines de réplication réparties le long de l’ADN, et chez l’humain, on estime qu’il existe plusieurs dizaines de milliers d’origines potentielles dans le génome.
Chargement et activation de l'hélicase pendant le cycle cellulaire
(Figure : vetopsy.fr d'après Bell et Labib)
Licensing des origines pendant la phase G1
Structure et recrutement du complexe pré‑réplicatif (pré-RC)
(Figure : vetopsy.fr d'après Bell et Labib)
Le terme licensing, littéralement " mise en capacité ", désigne le processus par lequel une origine de réplication est rendue compétente pour initier la réplication lors de la phase S suivante.
a. Le complexe MCM (MiniChromosome Maintenance protein complex), i.e. MCM2-7, est une hélicase hexamérique appartenant à la famille des protéines AAA+ ATPases.
b. Le complexe Cdt1-MCM2-7 permet :
l’ouverture de la porte MCM2–MCM5 qui agit comme une porte moléculaire permettant l’ouverture transitoire de l’anneau MCM,
Remarque : " head-to-head ", signifie que les faces N-terminales des deux anneaux sont en contact (N–N) tandis que les domaines C-terminaux sont orientés vers l’extérieur.
Dans la littérature, cette organisation est parfois décrite de manière simplifiée comme " tête-bêche ", pour décrire le fait que les deux hélicases partiront dans des directions opposées lors de l’activation.
a. Ce chargement du double hexamère constitue l’étape de licensing des origines, qui marque les sites potentiels de réplication, mais ne déclenche pas encore la duplication de l’ADN.
Le terme licensing, littéralement " mise en capacité ", désigne le processus par lequel une origine de réplication est rendue compétente pour initier la réplication lors de la phase S suivante.
b. Les origines licenciées restent inactives pendant la phase G1 et l’activation des origines se produit uniquement lors de l’entrée en phase S, après franchissement du point de restriction (R) lorsque les signaux mitogènes ont déclenché l’activité des kinases du cycle.
Lors de l’entrée en phase S, deux mécanismes de phosphorylation ont lieu simultanément pour initier l’ouverture de l’ADN et le démarrage de la réplication.
a. La phosphorylation de Treslin constitue un signal d’activation central des origines licenciées.
Sans phosphorylation de Treslin, le complexe MCM2-7 est chargé sur l’ADN, mais l’origine demeure inactive.
Treslin phosphorylé permet le recrutement de TopBP1 (DNA topoisomerase 2-binding protein 1), adaptateur essentiel qui coordonne le recrutement des composants nécessaires à l’activation de l’hélicase.
b. Ce complexe Treslin-TopBP1 favorise ensuite le recrutement de Cdc45 (Cell Division Cycle 45) sur le complexe MCM2-7 chargé sur l’ADN, qui constitue le cœur de l’hélicase réplicative issue du complexe pré-réplicatif (pré-RC).
Rôle du complexe cycline E/CDK2 dans la réplication de l'ADN
(Figure : vetopsy.fr d'après Fagundes et Teixeira)
3. À ce stade, les composants du complexe pré-réplicatif initial (pré-RC) sont fonctionnellement inactivés par plusieurs mécanismes qui empêchent tout nouveau chargement du complexe MCM2-7 sur l’ADN et évitent ainsi toute re-réplication du génome.
La protéine Cdt1 est inhibée par la protéine Geminin, qui se lie à Cdt1 et bloque sa capacité à recruter de nouveaux complexes MCM sur l’ADN.
La protéine Cdc6 est phosphorylée par les complexes cycline/CDK, ce qui entraîne son export du noyau ou sa dégradation, empêchant ainsi la formation de nouveaux complexes pré-réplicatifs.
Le complexe ORC, en revanche, peut rester associé à la chromatine après l’initiation de la réplication, mais son activité est inhibée par phosphorylation dépendante des CDK.
Ce contrôle empêche qu’une origine déjà activée puisse être licenciée de nouveau au cours du même cycle cellulaire, ce qui garantit que chaque segment du génome est répliqué une seule fois par cycle.
Ouverture de la double hélice et fourches de réplication
Formation de l’hélicase active CMG
1. Le complexe Treslin-TopBP1 favorise le recrutement de Cdc45 (Cell Division Cycle 45) sur le complexe MCM2-7 chargé sur l’ADN, qui constitue le cœur de l’hélicase réplicative issue du complexe pré-réplicatif (pré-RC).
Au sein de l’hélicase réplicative CMG (Cdc45-MCM-GINS), Cdc45 contribue à l’activation et à la stabilisation de l’hélicase MCM, permettant l’ouverture du duplex d’ADN et la progression de la fourche de réplication (Structure of human Cdc45 and implications for CMG helicase function 2016).
Elle reste associée au complexe CMG pendant l’élongation et participe à l’organisation du réplisome en facilitant l’interaction de l’hélicase avec les polymérases réplicatives.
Structure du coeur du réplisome humain
(Figure : vetopsy.fr d'après Jones et coll)
Il est constitué de quatre sous-unités conservées : Sld5, Psf1, Psf2 et Psf3 (GINS provenant du japonais Go-Ichi-Ni-San, « 5-1-2-3 »).
Au sein de ce complexe, GINS stabilise la structure active de l’hélicase et participe à la progression de la fourche de réplication en coordonnant l’ouverture du duplex d’ADN avec l’activité des polymérases réplicatives.
Formation du complexe CMG à partir du double hexamère MCM2-7
(Figure : vetopsy.fr d'après Lewis et coll)
L’initiation de la réplication implique donc l’ouverture locale de la double hélice d’ADN, permettant la séparation des deux brins parentaux qui peuvent alors servir de matrices pour la synthèse de nouveaux brins complémentaires.
b. Chaque origine licenciée donne naissance à deux fourches de réplication bidirectionnelles.
Structure de l'hélicase CMG
(Figure : vetopsy.fr d'après Abid Ali et coll)
a. Le moteur catalytique de cette hélicase est constitué par l’anneau hexamérique MCM2-7 qui forme un anneau protéique entourant l’ADN simple brin ( mécanisme du domaine AAA).
Pour que l’ADN puisse entrer dans ce canal central, l’anneau doit s’ouvrir transitoirement à l’interface entre MCM2 et MCM5 (MCM2–MCM5 gate).
L’hydrolyse séquentielle de l’ATP par les sous-unités MCM induit des changements conformationnels coordonnés qui entraînent la translocation de l’hélicase le long de l’ADN dans le sens 3' → 5' sur le brin matrice directeur.
L’anneau MCM progresse sur un brin d’ADN tandis que l’autre brin est exclu du canal central, ce qui provoque la rupture progressive des interactions d’appariement entre les bases et l’ouverture de la double hélice.
Deux configurations dans le complexe ATPγS-CMG-ADN
(Figure : vetopsy.fr d'après Abid Ali et coll)
b. Les protéines Cdc45 et GINS ne constituent pas le moteur catalytique de l’hélicase mais jouent un rôle essentiel dans son activation et sa stabilité structurale.
Leur association avec MCM2-7 verrouille l’anneau hélicase dans une conformation active et permet le couplage fonctionnel entre l’hélicase et les polymérases réplicatives au niveau de la fourche de réplication.
Modèle de déroulement de l'ADN de l'hélicase MCM2-7
(Figure : vetopsy.fr d'après Yuan et coll)
Remarque : dans cet état, l’anneau hexamérique MCM reste fermé autour de l’ADN simple brin, ce qui permet à l’hélicase de rester fixée à la molécule et d’avancer de manière hautement processive.
Cette séparation des deux brins permet à chacun d’eux de servir de matrice pour la synthèse d’un nouveau brin complémentaire.
À partir d’une origine de réplication, deux fourches se forment généralement et progressent dans des directions opposées le long de la molécule d’ADN, ce qui permet d’accélérer la duplication du génome.
2. La progression opposée de ces deux hélicases définit la bulle de réplication, structure transitoire dans laquelle l’ADN parental est ouvert et où s’organisent les deux réplisomes.
Le complexe CMG agit ainsi comme un moteur moléculaire processif, qui déroule l’ADN parental et alimente la fourche de réplication en ADN simple brin servant de matrice pour la synthèse des nouveaux brins.
Remarque : le complexe CMG constitue l'hélicase réplicative principale responsable de l'ouverture de la double hélice au niveau de la fourche de réplication.
D'autres hélicases, notamment les protéines de la famille RecQ telles que BLM, WRN, RECQL4 et RECQL5, interviennent principalement dans la surveillance, la stabilisation et le redémarrage des fourches de réplication lorsqu'elles rencontrent des lésions de l'ADN ou d'autres obstacles à leur progression.
Activation de l'origine et déroulement de la fourche de réplication par l'hélicase CMG
(Figure : vetopsy.fr d'après Abid Ali et coll)
Stabilisation de l'ADN simple brin par RPA
L’ADN simple brin exposé lors de l’ouverture de la double hélice est instable et tend spontanément à se réapparier ou à former des structures secondaires qui pourraient perturber la progression des ADN polymérases le long du brin matrice.
RPA se fixe avec une forte affinité sur l’ADN simple brin exposé au niveau de la fourche de réplication grâce à plusieurs domaines de liaison à l’ADN (OB-fold), et recouvre progressivement le simple brin par un mécanisme coopératif formant un filament nucléoprotéique protecteur.
Complexe RPA (Replication Protein A)
(Figure : vetopsy.fr d'après Nasheuer et coll)
2. Cette liaison possède plusieurs fonctions.
Elle empêche le réappariement spontané des deux brins parentaux.
Elle limite la formation de structures secondaires intramoléculaires telles que les épingles à cheveux, qui pourraient entraver la progression des ADN polymérases.
Elle protège également l’ADN simple brin de l’action des nucléases et maintient la matrice dans une conformation compatible avec l’activité des enzymes de réplication.
plusieurs protéines impliquées dans la synthèse de l’ADN, notamment la primase-ADN polymérase α lors de l’initiation des fragments d’Okazaki,
des facteurs de surveillance du génome tels que ATR et ATRIP, ainsi que le complexe Rad17-RFC, qui participent à la détection et à la signalisation des stress réplicatifs en réponse à l’accumulation d’ADN simple brin recouvert de RPA.
Stabilisation de la fourche de réplication par le complexe RPA (Replication Protein A)
(Figure : vetopsy.fr d'après Nasheuer et coll)
Remarque : en plus de son rôle structural dans la stabilisation de l’ADN simple brin lors de la réplication, RPA joue un rôle central dans l’activation du checkpoint de la phase S.
Lorsque la fourche de réplication est ralentie ou bloquée, l’ADN simple brin (ssDNA) s’accumule et est rapidement recouvert par RPA.
Le complexe RPA-ssDNA sert alors de plateforme de signalisation en recrutant la kinase ATR via son partenaire ATRIP, ce qui déclenche la cascade de surveillance du stress réplicatif et conduit à l’activation de Chk1, permettant de ralentir la progression des fourches et de stabiliser la réplication.
La formation des fourches de réplication expose les brins parentaux qui servent de matrices pour la synthèse des nouveaux brins d’ADN qui nécessite la mise en place du réplisome et le rôle des ADN polymérases dans la synthèse du brin directeur et du brin retardé.
synthèse de l'ADN).
