Acides nucléiques
ADN : réplication
Amorçage de la synthèse des nouveaux brins

La phase d’élongation correspond à la synthèse des nouveaux brins par les ADN polymérases réplicatives organisées au sein du réplisome selon plusieurs processus successifs :

• l’amorçage de la synthèse par le complexe primase-ADN polymérase α, qui fournit l’extrémité 3'-OH indispensable au démarrage de l’élongation,
• l’élongation coordonnée du brin directeur et du brin retardé et la maturation des fragments d’Okazaki,
• les mécanismes de correction d’épreuve (proofloading) assurant la fidélité de la synthèse de l’ADN,

Ces étapes correspondent aux différents mécanismes moléculaires qui assurent la progression et l’achèvement de la réplication du génome (terminaison de la duplication).

Synthèse des amorces par le complexe primase-ADN polymérase α

Structure du complexe primase-ADN polymérase α

La synthèse des nouveaux brins d’ADN ne peut pas débuter directement par l’action des ADN polymérases réplicatives, car ces enzymes sont incapables d’initier la synthèse de novo car elles nécessitent la présence d’une extrémité 3'-OH libre sur laquelle ajouter les nucléotides (How Pol α-primase is targeted to replisomes to prime eukaryotic DNA replication 2023).

Le complexe primase-ADN polymérase α initie la synthèse de courts segments nucléotidiques servant d’amorces à l’élongation des nouveaux brins et est composé de quatre sous-unités principales :

• Pri1 (p48), sous-unité catalytique de la primase, qui dérive du mot " primer " qui signifie amorce en anglais.
• Pri2 (p58), sous-unité régulatrice de la primase,
• PolA1 (p180), sous-unité catalytique de la polymérase α,
• PolA2 (p70), sous-unité régulatrice de la polymérase.

Synthèse de l'amorce

La synthèse de l’amorce se déroule alors en deux étapes successives (A mechanistic model of primer synthesis from catalytic structures of DNA polymerase α–primase 2025).

1. La primase Pri1 est une ARN polymérase spécialisée qui, contrairement aux ADN polymérases réplicatives :

• initie la synthèse de novo sans amorce préalable,
• polymérise des ribonucléotides (NTP) et non des désoxyribonucléotides.

a. Pri1 reconnaît l’ADN simple brin exposé à la fourche de réplication.

b. Elle commence la polymérisation d’un court ARN de 8 à 10 ribonucléotides par une réaction catalysée analogue à celle des autres polymérases, qui :

• est complémentaire du brin matrice d’ADN,
• possède une extrémité 3’-OH libre,
• constitue le point de départ de la synthèse d’ADN.

c. Cette synthèse est relativement lente et peu processive et la polymérase α possède une faible fidélité et aucune activité de relecture (proofreading) et n'est donc utilisée que pour initier la synthèse.

d. Le fait que l’amorce contienne de l’ARN présente un avantage fonctionnel car les ribonucléotides sont chimiquement distincts de l’ADN et peuvent être reconnus et éliminés spécifiquement comme lors de la maturation des fragments d’Okazaki.

Remarque : Pri2 est la sous-unité régulatrice de la primase dans le complexe primase-polymérase α.

• Son domaine C-terminal possède une capacité de liaison à l’ADN simple brin qui contribue au positionnement et à l'interaction de ce dernier avec Pri1, en l'orientant correctement dans le site actif et en facilitant la formation du premier dinucléotide qui initie la polymérisation de l'ARN.
• Pri2 participe également au contrôle de la longueur de l’amorce ARN (environ 8-10 nucléotides) et facilite ensuite le transfert de cette amorce vers la polymérase α, étape nécessaire pour la transition vers la synthèse d’ADN.

2. Une fois l’amorce ARN synthétisée, l’extrémité 3’-OH de l’ARN est transférée vers le site actif de la polymérase PolA1, sous-unité catalytique de la polymérase α.

La polymérase α prolonge alors cette amorce en ajoutant des désoxyribonucléotides (dNTP) et synthétise 20 à 30 nucléotides d’ADN.

Remarque : PolA2 est la sous-unité régulatrice de la polymérase α et forme un hétérodimère stable avec la sous-unité catalytique PolA1 et sert d’interface fonctionnelle entre la polymérase α et le module primase (Pri1-Pri2).

• Elle contribue ainsi à la coordination du passage de la synthèse ARN à la synthèse ADN, en facilitant le transfert de l’amorce ARN vers le site actif de PolA1.
• PolA2 participe également à l’ancrage et au positionnement correct du complexe primase-polymérase α dans le réplisome, ce qui permet l’extension efficace de l’amorce ARN par les premiers nucléotides d’ADN avant le relais vers les polymérases réplicatives principales.

3. Les états successifs du complexe primase-polymérase α pendant la synthèse de l’amorce hybride ARN-ADN sont les suivants (Molecular choreography of primer synthesis by the eukaryotic Pol α-primase 2023).

• a. L’initiation de la synthèse de l’amorce se produit lorsque le brin d’ADN simple brin matrice est positionné dans le complexe et stabilisé par Pri2, permettant à la primase Pri1 d’initier la synthèse de l’amorce ARN.
• b. Le début de la synthèse de l’ARN correspond à la polymérisation par la primase Pri1 des premiers ribonucléotides formant l’extrémité initiale de l’amorce ARN.
• c. L’allongement de l’amorce ARN se poursuit jusqu’à produire une amorce d’environ 8-10 nucléotides, longueur nécessaire pour la transition vers la polymérase α.
• d. Le transfert de l’amorce vers la polymérase α intervient lorsqu’un changement conformationnel rapproche le site actif de PolA1 de l’extrémité 3’ de l’amorce ARN.
• e. Le début de la synthèse d’ADN correspond à l’ajout par la polymérase α des premiers désoxyribonucléotides à l’extrémité 3’ de l’amorce ARN.
• f. La formation de l’amorce hybride ARN-ADN résulte de l’extension de l’amorce par la polymérase α, produisant un court segment ARN-ADN servant de point de départ aux polymérases réplicatives.

4. L'amorce hybride ARN-ADN fournit l’extrémité 3'-OH nécessaire à l’intervention des polymérases réplicatives (Molecular choreography of primer synthesis by the eukaryotic Pol α-primase 2023).

• Sur le brin directeur, cette amorce n’est utilisée qu’une seule fois au début de la réplication, car la synthèse se poursuit ensuite de manière continue par l’ADN polymérase ε.
• Sur le brin retardé, en revanche, la synthèse discontinue impose qu'une nouvelle amorce ARN-ADN soit synthétisée à intervalles réguliers afin de permettre l’élongation successive des fragments par l’ADN polymérase δ.

Stabilisation et protection de la fourche de réplication

La synthèse des amorces et l’élongation des nouveaux brins sont étroitement coordonnées au sein du réplisome, complexe multiprotéique organisé autour de l’hélicase CMG.

1. La protéine Ctf4 (Chromosome transmission fidelity 4), appelée aussi AND1, agissant sous forme de trimère, joue un rôle central dans l'architecture du réplisome en agissant comme un adaptateur reliant l'hélicase CMG au complexe primase-polymérase α, facilitant ainsi la synthèse de ces amorces.

a. AND1 est composé par :

• un domaine WD, impliqué dans les interactions protéiques, en particulier le complexe CMG, notamment via la sous-unité Sld5 du complexe GINS.
• un domaine SepB-like, domaine central conservé impliqué dans la trimérisation et l'interaction avec DONSON, protéine associée à la fourche qui contribue à la stabilité fonctionnelle du réplisome,
• un domaine HMG box-like capable d’interagir avec l’ADN et avec la primase-polymérase α.

b. Grâce à ces interactions, la primase-polymérase α est ancrée près de la fourche de réplication au voisinage immédiat de l’ADN nouvellement déroulé, ce qui facilite la synthèse répétée des amorces nécessaires à la formation des fragments d’Okazaki.

Cette organisation contribue à maintenir une coordination étroite entre l’ouverture de la double hélice par l’hélicase CMG et la synthèse des nouveaux brins par les ADN polymérases.

2. D’autres protéines associées à l’avant de l'hélicase CMG participent à la stabilisation de la fourche de réplication, notamment le complexe Csm3-Tof1, appelé Timeless-Tipin chez les vertébrés (Tim1-TIPN1) qui joue un rôle important dans la protection et la régulation de la progression de la fourche.

a. En effet, la progression du réplisome ne s’effectue pas sur un ADN nu.

• La chromatine contient de nombreuses protéines associées, notamment les nucléosomes, les facteurs de transcription ou d’autres protéines liées à certaines séquences du génome.
• De plus, certaines régions de l’ADN peuvent adopter des structures secondaires particulières, comme des épingles à cheveux ou des structures riches en guanine (G-quadruplexes), qui rendent l’ouverture de la double hélice plus difficile.

b. Le complexe Csm3-Tof1 s’associe à l’avant de l’hélicase CMG et agit comme un module de stabilisation de la fourche de réplication (A new model for coordinating the functions of TIMELESS at the replication fork 2025).

• Il maintient le contact entre l’hélicase et l’ADN parental et contribue à synchroniser la vitesse d’ouverture de la double hélice avec la synthèse des nouveaux brins par les ADN polymérases.
• Lorsque la fourche rencontre un obstacle, ce complexe contribue à ralentir ou à stabiliser la progression de l’hélicase afin d’éviter une dissociation du réplisome ou une accumulation excessive d’ADN simple brin.

c. Il agit ainsi comme un système de régulation mécanique et fonctionnelle qui permet au réplisome de franchir ou de contourner les obstacles tout en maintenant l’intégrité de la fourche de réplication.

Remarque : les obstacles rencontrés par la fourche de réplication sont levés par une combinaison de mécanismes complémentaires :

• déplacement et recyclage des nucléosomes, par exemple par les chaperonnes d’histones FACT, ASF1 et le complexe CAF-1,
• action d’hélicases spécialisées sur les structures secondaires de l’ADN, par exemple les hélicases PIF1, BLM ou WRN (Eukaryotic Pif1 helicase unwinds G-quadruplex and dsDNA using a conserved wedge 2024).
• dissociation ou remodelage des protéines liées à l’ADN, par exemple par des remodeleurs de la chromatine comme INO80, SWI/SNF ou ISWI.

Synthèse du brin directeur et du brin retardé

Après la formation des amorces par le complexe primase-ADN polymérase α, les polymérases réplicatives prennent le relais et assurent l’élongation des nouveaux brins d’ADN.

Cette synthèse se déroule selon deux modalités distinctes correspondant au brin directeur et au brin retardé, dont les mécanismes seront examinés dans le chapitre suivant.