Les sous-unité α ont été étudiées dans un chapitre spécial.

Sous-unités Gβ/γ

Gγ est nécessaire pour que Gβ se replie correctement.

Les sous-unités β et γ n'ont pas de site catalytique.

Ces sous-unités inactivatrices de Gα permettant la reformation de l’hétérotrimère qui peut enclencher le prochain cycle de signalisation en se liant à nouveau au récepteur activé.

Ce sont des modulateurs, contrairement aux sous-unités α et le complexe β/γ agit comme molécule signal.

Les sous-unités Gβγ ont à la fois des fonctions de régulation et de signalisation en servant par exemple d'échafaudage pour des kinases ou comme modulateurs des canaux ioniques (Gβγ subunits-Different spaces, different faces 2016)

Structure des sous-unités β/γ

1. La sous-unité β est formée par :

• une hélice α N-terminale,
• un β-propeller, i.e. feuillets β en forme de lames autour d'un axe central selon une configuration toroïdale.

Le β-propeller est formé par sept répétitions WD de 43 acides aminés, retrouvés dans de nombreuses famille de protéines, et sept feuillets β antiparallèles à 4 branches, avec une connection entre WD1 et WD7 pour maintenir la structure protéique.

2. La sous-unité γ est formée par deux hélices α reliées par une boucle intermédiaire.

3. Les interactions entre les deux sous-unités sont formées par :

• la conformation en coiled-coil (superhélice) avec l'hélice α N-terminale de β ( superhélices des Rpt pour la conformation).
• le long du bord extérieur de la configuration toroïdale.

Il convient de noter que le site de liaison effecteur sur G se chevauche de manière significative avec la région re-sponsite pour le commutateur de liaison II de G près du pore central de Theg Torroïd (Fig. 3B). Des sites d'interaction supplémentaires existent pour chaque complexe spécifique (Gaudet et al., 1996; Lodowski et al., 2003; Davis et al., 2005).

Diversité des sous-unités β/γ

1. La sous-unité β est codée par 5 gènes différents (Gβ1-Gβ5)

2. La sous-unité γ est codée par 12 gènes (Gγ1-Gγ5 et Gγ7-13).

3. Les protéines Gα pourraient donc s’assembler avec différents dimères β/γ, lors de la formation de l’hétérotrimère, i.e. chaque combinaison pouvant activer différents effecteurs de la signalisation (G protein βγ subunits: Central mediators of G protein-coupled receptor signaling 2009). DESSIN

Les sous-unités β/γ ont de nombreux rôles :

• activation des courants potassiques rectifiants via les canaux GIRK (G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channels),
• l’inhibition des canaux calcium dépendant du voltage
• l’activation de certains isoformes de PLC (PLCβ, ε et η), de la phosphoinositide 3- kinase (PI3K) et des MAPK .
• la modululation de l’activité de certains isoformes de l’adénylate cyclase (Gβγ Activation Site in Adenylyl Cyclase Type II: ADENYLYL CYCLASE TYPE III IS INHIBITED BY Gβγ 2006).

Interactions de l'hétérotrimère Gαβγ

Les interactions entre les sous-unité Gα et Gβ/γ sont formés par deux sites principaux.

1. La boucle β3/α2 et l'hélice α2 (Switch II) de Gα s'enfonce dans six des sept répétitions de WD (spécifiquement les boucles DA et BC) de Gβ.

Cette interaction est principalement réalisée par le coeur hydrophobe de Gα centré autour du Trp211 (positionné au-dessus de la fente α2/α3) et Trp99 de Gβ est est à la base de :

• l'activité inhibitrice de la dissociation de GTP par Gβ/γ,
• la compétition lors de la liaison des Gα-GDP et des effecteurs Gβ/γ.

Cette région est maintenant considérée comme la région de reconnaissance des effecteurs de Gβ/γ. (Lodowski et al., 2003; Davis Etal., 2005).

2. La première lame du β-propeller de Gβ (brins D et boucles CD de WD1/2) entre en contact avec l'hélice α N-terminale de Gα, normalement région désordonnée dans les Gα isolées.

3. Rappelons que le trimère est lié à la membrane par la sous-unité α et γ ( queues lipidiques des protéines G) et qu'à l'état inactif le trimère est lié au GDP.

Cycle des protéines G

 

Universal allosteric mechanism for Gα activation by GPCRs (2015). DESSIN et interactions lipides

1. Protéines G au repos

Quand la protéine G n'est pas activée, elle est :

• 

  trimérisée (α/β/γ) avec sous-unité α liée au GDP,
• attachée à la membrane par les queues lipidiques de la sous-unité α et γ.

2. Activations des protéines G

L'activation des protéines G peut être provoquée par deux processus.

2a. Le premier processus, dit canonique, est lié au récepteur couplé à la protéine G (GPCR) :

• soit par la fixation du ligand sur le GPCR, le plus courant ( couplage par collision),
• soit par la fixation de la sous-unité Gα au GPCR en l'absence de ligand ( pré-couplage du récepteur),

En outre, la durée de la signalisation des protéines G hétérotrimériques, i.e. durée de vie de la sous-unité Gα-GTP, peut être modulée par diiférentes protéines (The GAPs, GEFs, and GDIs of heterotrimeric G-protein alpha subunits 2005). DESSIN

• Les GAP, GTPase-Activating (ou Accelerating) Protein ou protéines activatrices de GTPase, comme la famille des RGS qui contiennent le domaine RGS d'environ 120 résidus, mais aussi d'autres domaines fonctionnels, activent l'hydrolyse de GTP, i.e. diminuent la signalisation.
• Les GDI, Guanine nucleotide Dissociation Inhibitor ou inhibiteurs de la dissociation des nucléotides de la guanine, inhibent la dissociation du GDP, donc la fixation du GTP, i.e. diminuent la signalisation.
• D'autres protéines accessoires entrent aussi en jeu.

2b. Le deuxième processus, non canonique et bien moins connu, est lié aux GEM, Guanine-nucleotide Exchange Modulators. qui se distingue par leur capacité à moduler les protéines G hétérotrimériques indépendamment des GPCR (The GAPs, GEFs, GDIs and...now, GEMs: New kids on the heterotrimeric G protein signaling block 2017).

Les GEM ont d'abord été découverts dans la protéine GIV (Gα-Interacting Vesicle-associated protein)/Girdin puis dans d'autres molécules (Heterotrimeric G protein signaling via GIV/Girdin: Breaking the rules of engagement, space, and time 2017).

Les GEM sont des protéines cytosoliques qui agissent uniquement comme (GIV/Girdin activates Gαi and inhibits Gαs via the same motif 2016).

• GEF pour Gα_i,
• GDI pour Gα_s.

Les GEM utilisent toutes le même motif GEM conservé d'environ 30 résidus, homologue d'un peptide synthétique KB752 qui peut se lier et activer Gαi (Structure of Gαi1 Bound to a GDP-Selective Peptide Provides Insight into Guanine Nucleotide Exchange 2005). DESSIN

Le motif GEM de GIV/Girdin contient 31 acides aminé (1671-1701) : KTGSPGSEVVTLQQFLEESNKLTSVQIKSSS)

La dérégulation de la signalisation GEM provoque des maladies comme le cancer, la fibrose organique ou le diabète.

Conséquences

3. Cette fixation provoque (Mechanistic insights into GPCR-G protein interactions 2017) plusieurs phénomènes. DESSIN

L’hélice α5 de Gα s’insère dans une cavité formée suite au mouvement vers l'extérieur caractéristique de l'hélice transmembranaire 6 (TM6) du GPCR (activation des GPCR : couplage à la protéine G).

Le mouvement de l’hélice a5 de Gas :

• ibère l’accès à la poche de liaison du nucléotide, i.e. l'ouverture de la poche de liaison aux nucléotides de Gα, GDP occupant ce site dans la forme inactive.
• favorise la libération du GDP de Gα, i.e. on retrouve un stade intermédiaire où le complexe GPCR-Gα se retrouve sans nucléotide.

Le Gα fixe alors le GTP, beaucoup plus abondant dans le cytoplasme que le GDP.

4. L'échange GDP/GTP :

• dissocie la protéine G en Gα-GTP et Gβ/γ qui vont pouvoir exercer leurs différentes fonctions en activant de nombreux effecteurs.
• libère le GPCR activé (R*) qui peut se lier et interagir avec une autre molécule de protéine G, i.e. amplifiant le signal.

5. Puis, Gα hydrolyse son GPT pour former Gα·GDP qui a une faible affinité pour les effecteurs, mais une affinité élevée pour Gβγ.

Ainsi, l'hétérotrimère (Gαβγ) lié au GDP inactif est reformé, capable à nouveau d'interagir avec le récepteur activé.

Effecteurs des proéines G

Le récepteur actif libéré peut se lier et activer une autre molécule de protéine G, ce qui fournit une amplification du signal à ce niveau.

Les effecteurs des protéines G sont :

• soit des canaux ioniques,
• soit des enzymes.

L'activation d'une seule molécule effectrice induit le mouvement de nombreux ions à travers la membrane plasmique ou la conversion de nombreuses molécules de substrat en produit, fournissant une amplification supplémentaire du signal.

Parmi les systèmes pilotés par GPCR, l'amplification du signal est la plus élevée dans les photorécepteurs des bâtonnets, ce qui confère à ces cellules une sensibilité à un seul photon (Responses of retinal rods to single photons 1979).

Toutefois, les effecteurs cellulaires ont un coût énergétique pour la cellule, i.e. il faut donc pouvoir arrêter la signalisation.

Dans le cas des GPCR, la désactivation rapide du signal est accomplie par un mécanisme conservé en deux étapes : la phosphorylation du récepteur par les GRK suivie d'une liaison à l'arrestine..

Complementary biosensors reveal different G-protein signaling modes triggered by GPCRs and non-receptor activators 2021

 

 

Les premières études qui ont montré l'interface entre un récepteur couplé aux protéines G (GPCR) et une protéine G, ici G_s, et le changement de conformation lors de la formation du complexe (GPCR-G_s), ont été réalisées sur le récepteur adrénergique β2 (β₂AR) lié à Gs Crystal (Structure of the β2Adrenergic Receptor-Gs protein complex 2012).

Par la suite, des articles ont suivi dont les plus récents sont sur les complexes :

• récepteur de l'adénosine A1-G_s (Structure of the adenosine-bound human adenosine A1 receptor-Gi complex 2018)
• récepteur de la sérotonine 5-HT1B-G_o (Cryo-EM structure of the serotonin 5-HT 1B receptor coupled to heterotrimeric G 2018),
• rhodopsine-G_i (Cryo-EM structure of human rhodopsin bound to an inhibitory G protein 2018),
• récepteur opioïde μ-G_i ou μOR-Gi (Structure of the μ Opioid Receptor-Gi Protein Complex 2018).

The importance of ligands for Gprotein-coupled receptor stability 2015

Les structures du β₂AR à l'état inactif et du complexe β₂AR-Gs sans nucléotide montre des changements structurels aux interfaces récepteur-Gs (Figure 1B) :

• 1. La boucle intracellulaire 2 (ICL2) forme une hélice.
• En particulier F139 du β₂AR forme une poche hydrophobe formée par la charnière αN/β1, la boucle β2/β3 et F376 dans laquelle s'engage l'hélice α5 de G_s.
• 2. L'extrémité N d'ICL3 forme une hélice α qui étend le domaine transmembranaire 5 (TM5) et TM6 se déplace vers l'extérieur.
• Le mouvement vers l'extérieur de TM6 forme un espace dans le noyau cytosolique du β₂AR formé par ICL2 et les TM 3, 5 et 6, dans lequel se loge l'extrémité C-terminale de G_s.

 

Une comparaison des structures du β₂AR à l'état inactif et du complexe β₂AR-Gs sans nucléotide révèle des changements structurels aux interfaces récepteur-Gs (Figure 1B) : la boucle intracellulaire 2 (ICL2) forme une hélice ; l'extrémité N d'ICL3 forme une hélice α en tant qu'extension du domaine transmembranaire 5 (TM5); et TM6 se déplace vers l'extérieur. L'ICL2, en particulier F139, du β₂AR engage la poche hydrophobe formée par la charnière αN/β1, la boucle β2/β3 et F376 à l'hélice α5 de Gαs (Figures 1C et 1D, vert), tandis que le mouvement vers l'extérieur de TM6 fournit un espace dans le noyau cytosolique du β₂AR formé par ICL2 et les TM 3, 5 et 6, dans lequel le terminus C de Gαs peut s'insérer (Figures 1C et 1D, rouge). Comprendre le timing et l'orchestration de ces interactions peut être essentiel pour comprendre la sélectivité du couplage et le chemin d'activation fonctionnelle.

 

 

hangement de conformation lors de la formation du complexe (GPCR-G_s), présentées suggèrant une séquence d'événements conduisant à la libération de nucléotides comme dans le récepteur adrénergique β2 (β₂AR) lié à Gs Crystal (Structure of the β2Adrenergic Receptor-Gs protein complex 2012)

1. Le β₂AR lié à l'agoniste engage initialement la moitié C-terminale de l'hélice α5, y compris les 5 derniers résidus relativement flexibles de la queue C-terminale des Gα liés au GDP (figure 5A, i et ii).

Nous n'avons aucune couverture pour la queue C-terminale par HDX-MS ou HRF-MS, mais elle sera probablement nécessaire pour l'interaction initiale avec le noyau transmembranaire β₂AR car, comme discuté ci-dessus, sans ces acides aminés (Gs_Δ5 ), nous ne pouvons détecter aucune libération de GDP médiée par les récepteurs ou une interaction entre le β₂AR et le Gs_Δ5 dans le dosage du bimane (Figures 4A-4C). Le premier événement détecté par HRF-MS est une augmentation de la modification HRF de M386 détectée pour la première fois par 800 ms (figure 3A). Cette augmentation de la réactivité suggère que l

2. Les interactions de la moitié C-terminale de l'hélice α5 avec le β₂AR délogent la chaîne latérale M386 d'une poche, l'exposant ainsi au solvant (figure 3B).

L'interaction avec le β₂AR peut également déstabiliser d'autres interactions entre l'hélice α5 et la charnière αN/β1 et la feuille β (Figure 5A, ii).

Dans la structure cristalline des Gs liés au GDP (Liu et al., 2019), les interactions entre les acides aminés dans l'hélice α5 avec les acides aminés dans la charnière αN/β1 et la feuille stabilisent la poche de liaison au GDP (Figure 5B).

La perturbation de ces interactions peut être suffisante pour déstabiliser la poche de liaison nucléotidique.

Conformément à cette hypothèse, la mutation de H387 et Q390 en Ala, qui devrait perturber deux de ces interactions stabilisatrices, a entraîné une multiplication par 4 de la libération de GDP basal dans Gαs (Liu et al., 2019).

3. Le HRF montre une augmentation transitoire du marquage oxydatif de M221 et F376 qui culmine à 1 500 ms (figure 3A) suggérant une augmentation transitoire de l'exposition aux solvants pour M221 et F376. Cela peut se produire pendant

3. Le mouvement ascendant de l'hélice α5 dans le noyau du récepteur provoque une augmentation transitoire de l'exposition aux solvants pour M221 et F376 (figures 3C et 5A, iii).

Ceci est suivi par des changements dans ICL2 compatibles avec la formation d'une structure en hélice qui favoriserait l'insertion de F139 dans ICL2 dans la poche hydrophobe formée par l'hélice 5 et la feuille β.

Ces changements déstabiliseraient davantage les interactions du GDP avec la boucle P et le motif TCAT conduisant à la libération du GDP, que nous observons comme étant complète en 10 s (figure 2A), suivie de la liaison au GTP et de la dissociation complexe (figure 5A, iii et iv) .

 

Nos résultats suggèrent que l'engagement initial entre le β₂AR et les G liés au GDP peut impliquer des interactions d'acides aminés différentes de celles observées dans la structure cristalline aux rayons X du complexe β₂AR-Gs sans nucléotide. Nous avons récemment obtenu une structure du β₂AR en complexe avec les 14 derniers acides aminés de l'hélice α5 (Liu et al., 2019). Dans cette structure, R389 et E392 de l'hélice α5 engagent D1303.49 et R1313.50 de la serrure ionique β₂AR, tandis que R389 et E392 sont exposés au solvant dans la structure β₂AR-Gs. Fait intéressant, dans la structure β₂AR-GsGDP, R389 et E392 font face au solvant (Figure 5B) (Liu et al., 2019) et sont donc plus facilement accessibles pour engager le 2AR lié à l'agoniste.

 

Le domaine -hélicoïdal (AHD) joue un rôle dans la liaison au GDP et l'hydrolyse du GTP.

Lorsque les domaines AHD et Ras-like sont exprimés sous forme de protéines séparées, la liaison de GTPγS au domaine Ras-like dépend de la co-incubation avec l'AHD (Markby et al., 1993). Il est possible qu'une protéine cytosolique puisse se lier à l'AHD et l'empêcher de se fermer (Figure 5A, vi). Cela pourrait altérer l'affinité pour le GTP et ralentir ainsi la dissociation médiée par le GTP.

Pour tester l'hypothèse selon laquelle empêcher la fermeture de l'AHD pourrait prolonger la stabilité du complexe β₂AR-Gs en présence de GTP, nous avons surveillé la dissociation du complexe induite par le GTP en présence ou en l'absence du nanocorps 37 (Nb37). Il a déjà été démontré dans des études de microscopie électronique à coloration négative que Nb37 se lie à la pointe de l'AHD empêchant la fermeture (Westfield et al., 2011). Pour surveiller la dissociation complexe, le β₂AR marqué au bimane sur C265 a été utilisé. La liaison de Gs au β₂AR marqué au bimane occupé par un agoniste a entraîné une diminution de l'intensité et un décalage vers le rouge de λmax (figure 4B). L'ajout de GTP a conduit à la dissociation du complexe β₂AR-Gs entraînant une augmentation rapide de la fluorescence du bimane indiquant une demi-vie de dissociation de 48 s (figure 5C). En présence de Nb37, nous n'avons observé aucune dissociation sur 900 s. De plus, nous n'avons pas pu détecter la liaison à l'analogue fluorescent de GTP BODIPY-GTPγS (figure 5D).

Ainsi, il est possible qu'une protéine cytosolique se liant à l'AHD puisse empêcher la conformation fermée et donc prolonger la conformation sans nucléotide. Il n'y a actuellement aucune protéine connue pour se lier à l'AHD de Gs à l'état sans nucléotide, donc la signification de cette observation n'est pas connue.

En conclusion, nous avons utilisé une combinaison de deux techniques MS complémentaires résolues en temps (HDX-MS et HRF-MS) pour surveiller la dynamique structurelle de la protéine G Gs lors du couplage avec le β₂AR pour comprendre le chemin fonctionnel de la signalisation.

L'engagement initial avec l'extrémité carboxy-terminale de l'hélice 5 est nécessaire, mais pas suffisant pour favoriser la libération de GDP.

L'interaction avec F139 dans ICL2 est une étape cruciale pour la libération de GDP et probablement nécessaire pour la stabilisation du complexe β₂AR-Gs sans nucléotide.

À la suite de ces résultats, nous suggérons que la conformation de la structure initial2AR-Gs initiale est susceptible de différer de celle observée dans la structure à haute résolution du complexe β₂AR-Gs stable sans nucléotides, et cette interaction transitoire initiale peut être critique pour déterminer la sélectivité du couplage. En raison de la couverture de séquence limitée du β₂AR, nous n'avons pas pu déterminer le site initial de contact avec Gs sur le récepteur et des études supplémentaires sont nécessaires pour cartographier avec précision les interfaces au cours de l'interaction transitoire initiale.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Domaine Ras-like

1. Les sous-unités α contiennent un domaine Ras-like, semblable au domaine Ras des petites GTPases contenant le domaine G, commun à toutes le GTPases,

L'activité GTPasique des protéines G est régulée par leur capacité à fixer et hydrolyser la guanosine triphosphate (GTP) en guanosine diphosphate (GDP) et un ion phosphate dans le domaine G.

Le domaine G est responsable de changements de conformation dépendant des nucléotides : il agit comme un commutateur moléculaire (switch) entre l'état désactivé lié au GDP (" off ") et l'état activé lié au GTP (" on "), par la réaction :

$\ce{GTP + H2O}$ $\leftrightharpoons$ $\ce{GDP + Pi}$

2. La liaison du GTP provoque un changement conformationnel dans trois régions.

• La P-loop ou boucle P dans G1 enserre le groupe phosphate dans une cavité.
• Switch I (SI) dans G2 est l'un des deux interrupateurs et forme une des connections entre les domaines rd et le domaine hd.
• Switch II (SII ou motif B de Walker) dans G3 forme une conformation partiellement hélicoïdale dans l'état actif et permet des interactions entre :

• la sous-unité α et β/γ,
• des effecteurs RGS,
• des protéines GoLoco,
• d'autres partenaires de liaison sélectifs aux nucléotides (par exemple, Kimple et al. , 2002; Johnstonet Al., 2005; Johnston et al., 2006).

La liaison du GTP :

• ermet des interactions favorables avec le phosphate-γ du GTP,
• provoque la dissociation entre la sous-unité α, et le complexe de sous-unités β/γ .

Domaine hd

2. Les sous-unités α contiennent un domaine composé de six hélices α.

Recent Progress in Understanding the Conformational Mechanism of Heterotrimeric G Protein Activation 2017

Classification des protéines G

Les protéines G,

1. Les protéines G proprement dites (ou grandes protéines G) forment des complexes hétérotrimériques composés d'une unité α, β, et γ (EC 3.6.5.1).

Les protéines G sont impliquées dans le signaux hormonaux et sensoriels, comportant 17 sous-unités α, 5 β et 12 γ différentes selon la protéine.

Les sous-unités α sont réparties dans :

• la classe Gs, i.e. s pour stimulateur de l'adénylate cyclase ;
• la classe Gi/o, i.e. i pour inhibiteur de l'adénylate cyclas, o pour others,
• la classe Gq/11, stimuleur de la phospholipase C,
• la classe G12/13, impliqué dans les petites GTPases de la famille rho qui entrent dans la régulation du cytosquelette et de certains processus liés au mouvement.

Les sous-unités β/γ fortement liées peuvent ausi agir sur des effecteurs différents après activation et dissociation de la protéine G.

2. Les petites GTPases sont appelées ainsi car elle se présentent sous forme monomérique (analogue à la sous-unité α des protéines G).

Les petites GTPases monomériques (EC 3.6.5.2) sont impliquées dans les cascades de transduction, comportant une cinquantaine de protéines appartenant à :

• la sous-famille Ras (RAs Sarcoma), impliqué dans le contrôle de l'expression des gènes, la prolifération, la différenciation et l'apoptose ;
• la sous-famille Rho (Ras HOmologous) régule l'organisation des réseaux du cytosquelette, le cycle cellulaire et l'expression génique ;
• la sous-famille Arf (Adp-Ribosylation Factor) et Rab (RAs d'abord décrite dans le cerveau, B pour brain), qui régule le transport vésiculaire et le déshabillage des vésicules ;
• la sous-famille Ran (RAs Nucléaire), la plus abondante dans la cellule, régule le transport noyau/cytoplasme des ARN et des protéines.

Rôles des protéines G

Les protéines G ont de multiples rôles.

1. Elles régulent un grand nombre de processus des machineries cellulaires :

• hormones,
• neurotransmetteurs,
• enzymes métaboliques,
• canaux ioniques,
• transporteurs,
• contrôle de la transcription,
• motilité,
• contractilité,
• sécrétion…

2. Elles sont impliquées dans diverses fonctions :

• développement embryonnaire,
• différenciation et prolifération cellulaire,
• migration,
• homéostasie,
• apprentissage et mémoire…

Grandes protéines G (hétérotrimériques)